引用本文： 李杰, 邢亚斯, 栗占荣, 路小楠, 戴淑真. 六个白化病家系的致病基因筛查及表型分析. 中华眼底病杂志, 2018, 34(6): 536-540. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.003 复制
白化病主要分为非综合征型的眼皮肤白化病（OCA）、仅累及眼部的眼白化病（OA）以及综合征型白化病三类。目前已鉴别出OCA的7种致病基因OCA1～7、OA致病基因GPR143（OA1）以及Hermansky-Pudlak综合征（HPS）、先天性白细胞颗粒异常综合征（CHS）等综合征型白化病的致病基因HPS1～9型与CHS1型等[1-2]。白化病的致病基因均与体内黑色素合成相关，如编码黑色素原的关键基因TYR、TYRP1，编码黑色素小体亚细胞结构的基因OCA2、SLC45A2、GPR143以及溶酶体相关细胞器发生复合体（BLOC）基因HPS1、AP3B1、HPS3、HPS4、HPS5、HPS6、DTNBP1、BLOC1S3、BLOC1S6、LYST等[3]。眼部损害是白化病的共有特征，也是功能上影响最严重的器官，主要包括虹膜视网膜色素沉积不足、黄斑发育不良及视觉纤维通路异常[4]。由于白化病患儿往往首诊于眼科，了解国人白化病的分类情况及临床特征以帮助眼科医生更好地认识该病具有重要的临床意义。本研究收集了河南省白化病6个家系的临床资料，并对其致病基因进行了分析。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性系列病例研究。本研究获河南省立眼科医院的机构审查委员会批准；严格遵循赫尔基辛宣言，所有受试者及未成年人受试者监护人均签署知情同意书。
2017年1月至2018年6月在河南省立眼科医院小儿遗传眼病门诊就诊的白化病先证者6例及其家系成员20名纳入本研究。先证者分别来自6个无血缘关系家系；其中，男性4例，女性2例。家系1、5、6为散发病例，家系2～4具有家族史。6例先证者中，5例（家系1～3、5、6）符合OCA的诊断，其皮肤白皙、毛发淡黄、虹膜及视网膜色素沉着不足；1例（家系4）符合OA的诊断，其仅表现为虹膜及视网膜色素沉着不足。6例先证者均存在眼球震颤、视力低下的表现，其中3例光相干断层扫描（OCT）检查证实黄斑中心凹变浅或消失。具有家族史的家系2中Ⅱ1、家系3中Ⅱ3以及家系4中Ⅰ1均具有与先证者相似表型。
抽取受试者外周静脉血并分离白细胞，TIANamp Blood DNA Kit试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因组DNA，应用Qubit® 2.0荧光计定量（美国Invitrogen公司）检测浓度及总量，并用琼脂糖凝胶电泳检测纯度及完整性。
由北京全谱医学检验实验室对受试者行全外显子组和Sanger测序。家系1、3、5、6选择家系Trios模式行全外显子组测序；家系2选择单人模式行全外显子组测序，另由Sanger测序法检测其他家系成员。DNA样本采用罗氏NimbleGen公司的V2捕获探针进行捕获，完成建库之后按照美国Illumina公司的Hiseq系列平台标准化流程上机测序，运用Basecall分析软件BclToFastq得到原始数据。原始数据经过质控后，采用Burrows-Wheeler Aligner比对软件与参考序列hg19进行比对统计。依次使用Samtools、Picard软件，生成去重复的bam文件；使用GATK软件分析出单核苷酸多态（SNP）、插入缺失标记等。根据测序深度，突变质量进行变异过滤（突变深度至少达到10倍，突变率达到30%以上，筛选突变质量值＞20）。然后采用PROVEAN（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）、SIFT（http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、MT（http://www.mutationtaster.org/）及MaxEntScan（http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html）等进行变异注释及危害预测。MT及Polyphen2：数值越接近1，致病性越高；SIFT：数值越接近0，致病性越高。二次过滤去除最小等位基因频率（MAF）5%以上的多态性突变，同义突变，内含子区域的突变。依据2015年发布的美国医学遗传学及基因组学会（ACMG）标准及指南[5]对突变进行致病性分级：1级，与疾病相关性较高；2级，与疾病可能相关；3级，与疾病相关性未知。最后根据家系共分离进一步分析筛选。家系4先证者选择Sanger测序法检测GPR143编码区及其邻近区域，并验证其他家系成员。
2 结果
全外显子组测序目标捕获区的平均测序深度均大于80倍、覆盖度均大于99%。排除在dbSNP144、千人基因组（1000 G）、Esp6500、HapMap Project等数据库中存在的突变位点，家系1～3、5、6剩余意义未知的突变数目分别为1672、1863、1613、1570、1930个。
优先分析已知白化病相关基因突变位点，结合生物信息学分析和家系共分离情况后，于4个家系中发现6个高致病突变，包括家系1、2的常染色体隐性复杂合突变[TYR（c.1037-7T＞A，c.925_c.926insC）、OCA2（c.2359G＞A，c.587T＞C）]和家系3、4的X染色体杂合突变[GPR143（c.11C＞G）、GPR143（c.333 G＞A）]（图1）。参照国际白化病中心数据库（http://www.ifpcs.org/albinism/index.html），6个突变中5个是新发现的（表1）。所有突变均由Sanger测序证实（图2），分别代表了OCA1型、OCA2型以及OA1型3种亚型。
图1
家系1～4家系图。1A～1D.家系1～4。□：正常男性；○：正常女性；■：患病男性；●：患病女性；↗：先证者；＋：野生型；0：男性无另一条X染色体
表1
突变阳性患者的基因突变及致病性分析
图2
家系1～4先证者Sanger测序图。2A.家系1先证者，TYR基因存在c.925_c.926insC与c.1037-7T＞A的复杂合突变（黑箭）；2B.家系2先证者，OCA2基因存在c.2359G＞A与c.587T＞C的复杂合突变（黑箭）；2C.家系3先证者，GPR143基因存在c.11C＞G错义突变（黑箭）；2D.家系4先证者，GPR143基因存在c.333G＞A无义突变（黑箭）
家系1先证者的两个变异分别来源于正常表型的父亲Ⅰ1和母亲Ⅰ2。验证家系2先证者的患病姐姐Ⅱ1及正常表型的侄子Ⅲ1后，证实两个变异分别位于不同染色体上。家系3先证者的母亲Ⅱ1是致病变异的杂合体；其父亲Ⅱ2基因型正常，但具有皮肤白皙、发质淡黄、虹膜淡黄的表现及家族史。家系4先证者存在GPR143（c.333G＞A）变异，其患病外公Ⅰ1具有相同基因型及临床表型；其母亲Ⅱ1及姨母Ⅱ3为杂合体，具有虹膜及眼底色素沉着不足等表现，眼底自身荧光检查可见泥浆泼溅样荧光改变（图3）。家系5先证者于OCA2基因发现杂合高致病变异（c.1079C＞T），但该基因未发现其他致病变异，故未能支持遗传学诊断。
图3
家系4先证者母亲（携带者）眼底自身荧光像。3A.右眼后极部；3B.左眼后极部；3C.右眼上方；3D.左眼颞侧。自身荧光不均匀，呈泥浆泼溅样改变
3 讨论
OCA是一类具有相似临床表型的疾病，均表现为眼部、皮肤及毛发的色素减少，同时伴随眼球震颤、视力低下等。其遗传基因异质性显著，根据基因型目前已有7种分型（OCA1～OCA7）[6]；此外，还包括HPS与CHS等隐匿合并其他脏器或系统病变的综合征，临床上仅根据表型很难确定其亚型[7]。全外显子组测序技术可以高效的发现突变，提供了便捷的分型及防治方法。本研究共收集6例白化病先证者，5例表现为OCA，1例表现为OA。OCA采用了全外显子组测序的方式，OA采用了Sanger直接测序的方式，发现4例携带可疑致病突变，丰富了国人白化病疾病的分布及临床表型特征。
国人白化病中OCA1是最常见类型，占56%；OCA2次之，占32%；OCA4占12%[8]。本研究家系1、2分别携带TYR和OCA2的复杂合突变，属于OCA1型和2型。其中家系1携带TYR基因未曾报道的插入突变（c.925_926insC），致使编码提前终止（p.T309Tfs*9），属于无义突变，具有高致病性；另外携带剪切突变c.1037-7T＞A引起编码体剪切方式改变，既往数次报道已予以证实[9-10]。上述无义突变和剪切突变的复杂合基因型可能保留了部分蛋白功能，因此家系1先证者展现了OCA1B的表型[11]。即随着年龄增长，出现了色素的沉积。家系2携带OCA2基因未曾报道的错义突变（C.587T＞C, p.L196P），位于外显子的重要功能域（clinvar数据库中该区域无良性变异），生物信息学预测变异对基因产物有影响，正常对照人群数据库中均未发现，属于低频高致病变异；另外携带的c.2359G＞A也属于新碱基变异，但其氨基酸改变p.A787T既往曾报道，属于已证实的突变类型[12]。此外，家系2先证者的患病姐姐携带以上两个变异，而其姐姐正常表型的儿子仅携带c.2359（exon23）G＞A。证明了两个变异位于不同染色单体上，属于复杂合突变。
家系3先证者呈典型的OCA表型，该患儿皮肤明显白皙，发质淡黄且并发眼部白化病表型；其父亲也具有皮肤白皙、发质淡黄、虹膜淡黄表现，但无眼球震颤与视力低下，父亲自述存在皮肤白皙，发质淡黄的家族史。我们首先采取了全外显子组测序的方法发现先证者GPR143基因携带高致病性突变（c.11C＞G, p.P4R），该突变为新发现突变。综合生物信息学分析及正常对照数据库信息后，ACMG预测可能致病；鉴于GPR143缺失变异可占1/3以上，而全外显子组测序不能有效发现，后续我们又应用了Sanger测序筛查，排除了其他缺失重复等变异。OA1型可以伴发轻度皮肤色素减退[13]。既往报道国人OA极少皮肤受累[14]。据此我们分析认为，先证者皮肤表型也可能遗传其父亲其他影响色素表达的因子，而其病因仍然属于母方遗传的OA可能性大，遗传分子学上的诊断与临床表型学上的诊断相符。
OA1型又称先天性眼球震颤6型，与先天性运动性眼球震颤的临床特征均为先天性眼球震颤、视灵敏度降低，且均常见于X染色体隐性遗传；而国人眼部色素缺失较之高加索人可能并不明显，容易混淆和误诊[15-16]。家系4先证者的表型为眼球水平震颤、视力低下、虹膜色素沉着不足及眼底色素缺乏，无皮肤或毛发色淡的表现；其外祖父有相似表型，OCT检查可见黄斑区无正常凹性结构，并符合X染色体隐性遗传特征，怀疑为单纯OA。我们采用Sanger测序法筛查了GPR143基因，发现新的高致病性突变（c.333G＞A, p.W111X, 294），属于无义突变，导致蛋白编码的提前终止，严重损害其功能；检查其正常表型的携带者母亲及姨母，发现也存在虹膜及眼底色素沉着不足表现，眼底自身荧光可见典型的泥浆泼溅样荧光改变，展现了不完全表型的特征。这符合既往关于OA1携带者会出现部分体征的认识[17]。
本研究在国人6个白化病家系中发现了4个家系具有基因突变，分别代表了OCA1、OCA2、OA1三种亚型，6个突变位点中5个是新位点；所有患者均存在黄斑中心凹发育不全的表现，皮肤、毛发、虹膜及眼底颜色具有较大的可变性。该结果揭示了国人白化病的基因型及表型特征，扩展了突变频谱。但由于家系样本采集不全，其结论尚需进一步研究给予验证。
白化病主要分为非综合征型的眼皮肤白化病（OCA）、仅累及眼部的眼白化病（OA）以及综合征型白化病三类。目前已鉴别出OCA的7种致病基因OCA1～7、OA致病基因GPR143（OA1）以及Hermansky-Pudlak综合征（HPS）、先天性白细胞颗粒异常综合征（CHS）等综合征型白化病的致病基因HPS1～9型与CHS1型等[1-2]。白化病的致病基因均与体内黑色素合成相关，如编码黑色素原的关键基因TYR、TYRP1，编码黑色素小体亚细胞结构的基因OCA2、SLC45A2、GPR143以及溶酶体相关细胞器发生复合体（BLOC）基因HPS1、AP3B1、HPS3、HPS4、HPS5、HPS6、DTNBP1、BLOC1S3、BLOC1S6、LYST等[3]。眼部损害是白化病的共有特征，也是功能上影响最严重的器官，主要包括虹膜视网膜色素沉积不足、黄斑发育不良及视觉纤维通路异常[4]。由于白化病患儿往往首诊于眼科，了解国人白化病的分类情况及临床特征以帮助眼科医生更好地认识该病具有重要的临床意义。本研究收集了河南省白化病6个家系的临床资料，并对其致病基因进行了分析。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性系列病例研究。本研究获河南省立眼科医院的机构审查委员会批准；严格遵循赫尔基辛宣言，所有受试者及未成年人受试者监护人均签署知情同意书。
2017年1月至2018年6月在河南省立眼科医院小儿遗传眼病门诊就诊的白化病先证者6例及其家系成员20名纳入本研究。先证者分别来自6个无血缘关系家系；其中，男性4例，女性2例。家系1、5、6为散发病例，家系2～4具有家族史。6例先证者中，5例（家系1～3、5、6）符合OCA的诊断，其皮肤白皙、毛发淡黄、虹膜及视网膜色素沉着不足；1例（家系4）符合OA的诊断，其仅表现为虹膜及视网膜色素沉着不足。6例先证者均存在眼球震颤、视力低下的表现，其中3例光相干断层扫描（OCT）检查证实黄斑中心凹变浅或消失。具有家族史的家系2中Ⅱ1、家系3中Ⅱ3以及家系4中Ⅰ1均具有与先证者相似表型。
抽取受试者外周静脉血并分离白细胞，TIANamp Blood DNA Kit试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因组DNA，应用Qubit® 2.0荧光计定量（美国Invitrogen公司）检测浓度及总量，并用琼脂糖凝胶电泳检测纯度及完整性。
由北京全谱医学检验实验室对受试者行全外显子组和Sanger测序。家系1、3、5、6选择家系Trios模式行全外显子组测序；家系2选择单人模式行全外显子组测序，另由Sanger测序法检测其他家系成员。DNA样本采用罗氏NimbleGen公司的V2捕获探针进行捕获，完成建库之后按照美国Illumina公司的Hiseq系列平台标准化流程上机测序，运用Basecall分析软件BclToFastq得到原始数据。原始数据经过质控后，采用Burrows-Wheeler Aligner比对软件与参考序列hg19进行比对统计。依次使用Samtools、Picard软件，生成去重复的bam文件；使用GATK软件分析出单核苷酸多态（SNP）、插入缺失标记等。根据测序深度，突变质量进行变异过滤（突变深度至少达到10倍，突变率达到30%以上，筛选突变质量值＞20）。然后采用PROVEAN（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）、SIFT（http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、MT（http://www.mutationtaster.org/）及MaxEntScan（http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html）等进行变异注释及危害预测。MT及Polyphen2：数值越接近1，致病性越高；SIFT：数值越接近0，致病性越高。二次过滤去除最小等位基因频率（MAF）5%以上的多态性突变，同义突变，内含子区域的突变。依据2015年发布的美国医学遗传学及基因组学会（ACMG）标准及指南[5]对突变进行致病性分级：1级，与疾病相关性较高；2级，与疾病可能相关；3级，与疾病相关性未知。最后根据家系共分离进一步分析筛选。家系4先证者选择Sanger测序法检测GPR143编码区及其邻近区域，并验证其他家系成员。
2 结果
全外显子组测序目标捕获区的平均测序深度均大于80倍、覆盖度均大于99%。排除在dbSNP144、千人基因组（1000 G）、Esp6500、HapMap Project等数据库中存在的突变位点，家系1～3、5、6剩余意义未知的突变数目分别为1672、1863、1613、1570、1930个。
优先分析已知白化病相关基因突变位点，结合生物信息学分析和家系共分离情况后，于4个家系中发现6个高致病突变，包括家系1、2的常染色体隐性复杂合突变[TYR（c.1037-7T＞A，c.925_c.926insC）、OCA2（c.2359G＞A，c.587T＞C）]和家系3、4的X染色体杂合突变[GPR143（c.11C＞G）、GPR143（c.333 G＞A）]（图1）。参照国际白化病中心数据库（http://www.ifpcs.org/albinism/index.html），6个突变中5个是新发现的（表1）。所有突变均由Sanger测序证实（图2），分别代表了OCA1型、OCA2型以及OA1型3种亚型。
图1
家系1～4家系图。1A～1D.家系1～4。□：正常男性；○：正常女性；■：患病男性；●：患病女性；↗：先证者；＋：野生型；0：男性无另一条X染色体
表1
突变阳性患者的基因突变及致病性分析
图2
家系1～4先证者Sanger测序图。2A.家系1先证者，TYR基因存在c.925_c.926insC与c.1037-7T＞A的复杂合突变（黑箭）；2B.家系2先证者，OCA2基因存在c.2359G＞A与c.587T＞C的复杂合突变（黑箭）；2C.家系3先证者，GPR143基因存在c.11C＞G错义突变（黑箭）；2D.家系4先证者，GPR143基因存在c.333G＞A无义突变（黑箭）
家系1先证者的两个变异分别来源于正常表型的父亲Ⅰ1和母亲Ⅰ2。验证家系2先证者的患病姐姐Ⅱ1及正常表型的侄子Ⅲ1后，证实两个变异分别位于不同染色体上。家系3先证者的母亲Ⅱ1是致病变异的杂合体；其父亲Ⅱ2基因型正常，但具有皮肤白皙、发质淡黄、虹膜淡黄的表现及家族史。家系4先证者存在GPR143（c.333G＞A）变异，其患病外公Ⅰ1具有相同基因型及临床表型；其母亲Ⅱ1及姨母Ⅱ3为杂合体，具有虹膜及眼底色素沉着不足等表现，眼底自身荧光检查可见泥浆泼溅样荧光改变（图3）。家系5先证者于OCA2基因发现杂合高致病变异（c.1079C＞T），但该基因未发现其他致病变异，故未能支持遗传学诊断。
图3
家系4先证者母亲（携带者）眼底自身荧光像。3A.右眼后极部；3B.左眼后极部；3C.右眼上方；3D.左眼颞侧。自身荧光不均匀，呈泥浆泼溅样改变
3 讨论
OCA是一类具有相似临床表型的疾病，均表现为眼部、皮肤及毛发的色素减少，同时伴随眼球震颤、视力低下等。其遗传基因异质性显著，根据基因型目前已有7种分型（OCA1～OCA7）[6]；此外，还包括HPS与CHS等隐匿合并其他脏器或系统病变的综合征，临床上仅根据表型很难确定其亚型[7]。全外显子组测序技术可以高效的发现突变，提供了便捷的分型及防治方法。本研究共收集6例白化病先证者，5例表现为OCA，1例表现为OA。OCA采用了全外显子组测序的方式，OA采用了Sanger直接测序的方式，发现4例携带可疑致病突变，丰富了国人白化病疾病的分布及临床表型特征。
国人白化病中OCA1是最常见类型，占56%；OCA2次之，占32%；OCA4占12%[8]。本研究家系1、2分别携带TYR和OCA2的复杂合突变，属于OCA1型和2型。其中家系1携带TYR基因未曾报道的插入突变（c.925_926insC），致使编码提前终止（p.T309Tfs*9），属于无义突变，具有高致病性；另外携带剪切突变c.1037-7T＞A引起编码体剪切方式改变，既往数次报道已予以证实[9-10]。上述无义突变和剪切突变的复杂合基因型可能保留了部分蛋白功能，因此家系1先证者展现了OCA1B的表型[11]。即随着年龄增长，出现了色素的沉积。家系2携带OCA2基因未曾报道的错义突变（C.587T＞C, p.L196P），位于外显子的重要功能域（clinvar数据库中该区域无良性变异），生物信息学预测变异对基因产物有影响，正常对照人群数据库中均未发现，属于低频高致病变异；另外携带的c.2359G＞A也属于新碱基变异，但其氨基酸改变p.A787T既往曾报道，属于已证实的突变类型[12]。此外，家系2先证者的患病姐姐携带以上两个变异，而其姐姐正常表型的儿子仅携带c.2359（exon23）G＞A。证明了两个变异位于不同染色单体上，属于复杂合突变。
家系3先证者呈典型的OCA表型，该患儿皮肤明显白皙，发质淡黄且并发眼部白化病表型；其父亲也具有皮肤白皙、发质淡黄、虹膜淡黄表现，但无眼球震颤与视力低下，父亲自述存在皮肤白皙，发质淡黄的家族史。我们首先采取了全外显子组测序的方法发现先证者GPR143基因携带高致病性突变（c.11C＞G, p.P4R），该突变为新发现突变。综合生物信息学分析及正常对照数据库信息后，ACMG预测可能致病；鉴于GPR143缺失变异可占1/3以上，而全外显子组测序不能有效发现，后续我们又应用了Sanger测序筛查，排除了其他缺失重复等变异。OA1型可以伴发轻度皮肤色素减退[13]。既往报道国人OA极少皮肤受累[14]。据此我们分析认为，先证者皮肤表型也可能遗传其父亲其他影响色素表达的因子，而其病因仍然属于母方遗传的OA可能性大，遗传分子学上的诊断与临床表型学上的诊断相符。
OA1型又称先天性眼球震颤6型，与先天性运动性眼球震颤的临床特征均为先天性眼球震颤、视灵敏度降低，且均常见于X染色体隐性遗传；而国人眼部色素缺失较之高加索人可能并不明显，容易混淆和误诊[15-16]。家系4先证者的表型为眼球水平震颤、视力低下、虹膜色素沉着不足及眼底色素缺乏，无皮肤或毛发色淡的表现；其外祖父有相似表型，OCT检查可见黄斑区无正常凹性结构，并符合X染色体隐性遗传特征，怀疑为单纯OA。我们采用Sanger测序法筛查了GPR143基因，发现新的高致病性突变（c.333G＞A, p.W111X, 294），属于无义突变，导致蛋白编码的提前终止，严重损害其功能；检查其正常表型的携带者母亲及姨母，发现也存在虹膜及眼底色素沉着不足表现，眼底自身荧光可见典型的泥浆泼溅样荧光改变，展现了不完全表型的特征。这符合既往关于OA1携带者会出现部分体征的认识[17]。
本研究在国人6个白化病家系中发现了4个家系具有基因突变，分别代表了OCA1、OCA2、OA1三种亚型，6个突变位点中5个是新位点；所有患者均存在黄斑中心凹发育不全的表现，皮肤、毛发、虹膜及眼底颜色具有较大的可变性。该结果揭示了国人白化病的基因型及表型特征，扩展了突变频谱。但由于家系样本采集不全，其结论尚需进一步研究给予验证。
