食管癌居我国恶性肿瘤死亡率的第 4 位，鳞状细胞癌（鳞癌）是我国食管癌的主要病理类型[1]。食管鳞癌恶性程度高，Ⅳ期患者 3 年生存率仅为 10.6%[2]。深入研究食管鳞癌的发病机理，将为食管鳞癌生物学机制的研究和治疗新靶点的发现奠定基础。
组蛋白甲基化修饰是调节染色质结构和基因转录的机制之一，在肿瘤的恶性发展过程中具有重要作用[3]。组蛋白甲基化由特异的组蛋白甲基化酶（histone methyltransferases，HMTs）和去甲基酶（histone demethylases，HDMs）协调完成，是一个可逆的动态修饰过程[4]。组蛋白甲基化酶 G9a 属于 SET 域家族，定位于染色体 6p21.33，是常染色质主要的组蛋白 H3K9 甲基转移酶，催化 H3K9 的单甲基化和二甲基化[5]。G9a 表达的失调或功能紊乱与黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌等肿瘤的发生相关，抑制 G9a 的表达或甲基转移酶活性可以诱导细胞发生衰老、周期阻滞、凋亡等，显示出强大的抗肿瘤活性，提示 G9a 是肿瘤潜在的治疗靶点[5-7]。
本文以体外培养的人食管鳞癌细胞为研究对象，观察组蛋白甲基化酶 G9a 抑制剂 BIX-01294 对细胞生长、增殖的影响；分析细胞的凋亡情况，以及 G9a 催化产物 H3K9me2、DNA 双链断裂标记和细胞凋亡相关蛋白表达的变化情况；探讨 G9a 抑制剂诱导食管鳞癌细胞凋亡的作用效应和分子机制。
1 试验材料与方法
1.1 药物和细胞株
BIX-01294 购自 MedChemExpress 公司（纯度≥98%）；DMSO 配成 50mM 的母液，−80℃ 保存。食管鳞癌细胞 EC109 和 KYSE150 购自中国科学院细胞库。
1.2 试剂
胎牛血清、RPMI 1640 培养液、0.25% 胰酶-0.02% EDTA 购自 Thermo 公司；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自 BD Pharmingen 公司；兔抗人 Histone H3K9me2、Histone H3、γH2AX、H2AX、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、GAPDH 多克隆抗体和 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体均购自 Cell Signaling Technology 公司；ECL 化学发光试剂购自 Millipore 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT 实验分析 BIX-01294 的细胞毒性作用
EC109 和 KYSE150 细胞按每孔 3×103 个接种于 96 孔培养板，贴壁后弃去上清，加入 100 μL 含 1、2.5、5、7.5 和 10 μM BIX-01294 的培养液，每组设 5 个复孔，对照组加入等体积的完全培养液。药物作用 24 h，MTT 法分析 BIX-01294 对细胞生长的影响，酶标仪测定各孔 490 nm 处吸光度值（A），计算细胞存活率（%）和半数抑制浓度（IC50），实验重复 3 次。
1.3.2 集落形成实验分析细胞的增殖能力
EC109 和 KYSE150 细胞以每孔 2×103 个细胞接种于 6 孔板。细胞贴壁后，实验组加入 IC50 浓度的含药培养液，对照组加入等体积的完全培养液，继续培养 7 d；4% 多聚甲醛溶液固定 15 min，0.5% 结晶紫溶液染色 10 min，观察各组细胞集落形成的情况。
1.3.3 流式细胞术检测凋亡率
EC109 和 KYSE150 细胞以每孔 3×105 个细胞接种于 6 孔板。细胞贴壁后，实验组加入 IC50 浓度的含药培养液，空白对照组加入等体积的完全培养液；BIX-01294 作用 24 h，收集各组细胞，加入 Annexin V-FITC 标记液（5 μL）和 PI（10 μL）混匀，室温避光孵育 15 min，加入 400 μL 1×结合缓冲液，上机检测细胞凋亡率。
1.3.4 免疫印迹实验检测蛋白的表达水平
细胞培养及药物处理同 1.3.3。提取 BIX-01294 作用 24 h 的各组细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度。取各实验组 30 μg 蛋白样品行 PAGE-SDS 电泳，300 mA 恒流电转移至 PVDF 膜。3% BSA 溶液封闭 1 h，一抗抗体室温孵育 2 h，TBST 缓冲液洗膜 3 次，二抗抗体室温孵育 1 h，TBST 缓冲液洗膜 3 次。滴加 ECL 试剂于凝胶成像系统内曝光，分析目的蛋白的表达，以 GAPDH 为实验内参。
1.4 统计学分析
采用 SPSS 21.0 统计软件包分析实验数据，各组数据采用均数±标准差（
±s）表示，采用 t 检验对数据进行统计学分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 BIX-01294 抑制食管鳞癌细胞的生长
不同浓度的 BIX-01294 作用 EC109 和 KYSE150 细胞 24 h，显著抑制食管鳞癌细胞的生长，呈剂量依赖关系；见图 1。BIX-01294 作用 EC109 细胞和 KYSE150 细胞 24 h 的半数抑制浓度（IC50）分别为 4.85 μM 和 5.91 μM。
图1
不同浓度 BIX-01294 对食管鳞癌细胞增殖的影响
*：
2.2 BIX-01294 抑制食管鳞癌细胞集落的形成
BIX-01294（IC50）作用 7 d，显著抑制 EC109 和 KYSE150 细胞集落的形成；见图 2。
图2
BIX-01294（IC50 浓度）对食管鳞癌细胞集落形成的影响
***：
2.3 BIX-01294 诱导食管鳞癌细胞凋亡
BIX-01294（IC50）作用 24 h，EC109 细胞凋亡率（含早期凋亡和晚期凋亡）为 42.5%±5.4%，与对照组（11.5%±2.1%）相比显著上升（P<0.05）；KYSE150 细胞凋亡率为 49.2%±5.2%，与对照组（7.5%±0.9%）相比显著上升（P<0.05）；见图 3。
图3
BIX-01294 诱导食管鳞癌细胞凋亡
***：
2.4 BIX-01294 抑制 G9a 催化产物的表达
免疫印迹实验发现，BIX-01294 作用 24 h，抑制 EC109 和 KYSE150 细胞表达 G9a 的催化产物 H3K9me2；见图 4。
图4
BIX-01294 抑制 G9a 催化产物的表达
**：
2.5 BIX-01294 促进 DNA 双链断裂标记蛋白的表达
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 细胞中 DNA 双链断裂标记蛋白 γH2AX 的表达水平显著上调；见图 5。
图5
BIX-01294 促进 DNA 双链断裂标记蛋白的表达
**：
2.6 BIX-01294 促进食管鳞癌细胞表达凋亡相关蛋白
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 细胞中 caspase3 和 PARP 的剪切片段 cleaved caspase3 和 cleaved PARP 的表达显著增加；见表 6。
图6
BIX-01294 促进食管鳞癌细胞表达凋亡相关蛋白
**：
2.7 BIX-01294 激活线粒体凋亡途径
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 细胞中 Bax 的表达显著增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达显著下降，cleaved caspase9 表达上升；见图 7。
图7
BIX-01294 激活线粒体凋亡途径
**：
3 讨论
研究证实，G9a 参与肿瘤细胞增殖[8]、侵袭转移[9]、干性维持[10]等生命活动的调控。我们发现，小分子化合物 BIX-01294 靶向抑制 G9a 具有诱导食管鳞癌细胞凋亡的作用。Wang 等[11]的研究结果显示，合成的 G9a 抑制剂 GA001 通过激活 p21/Bim 级联反应诱导乳腺癌细胞凋亡。BIX-01294 诱导急性 T 淋巴细胞白血病细胞[12]、肝癌细胞[13]的凋亡。86% 的胶质瘤组织中 G9a 表达阳性；BIX-01294 通过下调 Bcl-2 的表达，促进 Bax、caspase-3 和 caspase-9 的表达诱导 U251 细胞凋亡[14]。提示靶向抑制 G9a 诱导细胞凋亡是杀伤肿瘤的有效途径之一。
我们发现，DNA 双链断裂标记蛋白 γH2AX 的表达在 BIX-01294 组细胞中显著上调。磷酸化组蛋白 H2AX（phosphorylated H2AX，γH2AX）是 DNA 发生双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）时组蛋白 H2AX 的 C 末端第 139 位丝氨酸发生磷酸化的形式，γH2AX 聚集于 DSBs 位点，继而募集 DNA 损伤修复蛋白（53BP1、BRCA1 等）修复损伤维持基因组稳定性[15]。DSBs 是最致命的 DNA 损伤，不能修复的 DSBs 是诱发调亡的主要因素。在皮肤黑色素瘤组织中，γH2AX 的表达水平与 G9a 呈负相关[16]，提示 BIX-01294 诱导 DSBs 是其促进食管鳞癌细胞凋亡的机制之一。
线粒体凋亡途径的激活是启动细胞凋亡的诱因之一[17]。BIX-01294 抑制 G9a 的甲基转移酶活性可促进食管鳞癌细胞表达 Bax，并且抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达下降，cleaved caspase9 蛋白表达上升，表明线粒体凋亡途径参与 BIX-01294 诱导的食管鳞癌细胞凋亡。当 Bax 与 Bcl-2 比例上升或者 Bax 发生寡聚化将导致 Bax 在线粒体外膜上形成连通细胞质的孔道导致促凋亡内容物的外漏促进 caspase9 由酶原形式转变成活性形式，进而激活下游细胞凋亡信号通路[17]。caspase 级联反应中的效应蛋白 caspase3 在 BIX-01294 组细胞中被剪切激活；PARP 被 cleaved caspase3 水解成 89 和 24kD 的片段，失去修复 DNA 损伤的功能，受 PARP 负调控的核酸内切酶活性增高诱导细胞凋亡[18]。
本研究提示 G9a 可能是食管鳞癌潜在的治疗靶点。有研究[19]发现，抑制 G9a 的表达具有上调双特异性磷酸酶 4（DUSP4）的表达进而抑制 ERK1/2 通路诱导肿瘤细胞自噬性死亡的作用。G9a 通过抑制 CASP1 的表达抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭转移[9]。G9a 通过转录激活丝氨酸-甘氨酸生物合成通路促进肿瘤细胞的增殖[20]。BIX-01294 抑制 G9a 是否具有调控食管鳞癌细胞自噬和侵袭转移的作用及机制有待进一步的研究。
利益冲突：无。
作者贡献：吴中杰负责设计研究、初稿撰写；张雁飞、吕望、盛宏旭、朱林海负责查阅资料、数据整理和分析；胡奕负责论文审阅；胡坚指导和设计研究、负责论文审阅和修改。
食管癌居我国恶性肿瘤死亡率的第 4 位，鳞状细胞癌（鳞癌）是我国食管癌的主要病理类型[1]。食管鳞癌恶性程度高，Ⅳ期患者 3 年生存率仅为 10.6%[2]。深入研究食管鳞癌的发病机理，将为食管鳞癌生物学机制的研究和治疗新靶点的发现奠定基础。
组蛋白甲基化修饰是调节染色质结构和基因转录的机制之一，在肿瘤的恶性发展过程中具有重要作用[3]。组蛋白甲基化由特异的组蛋白甲基化酶（histone methyltransferases，HMTs）和去甲基酶（histone demethylases，HDMs）协调完成，是一个可逆的动态修饰过程[4]。组蛋白甲基化酶 G9a 属于 SET 域家族，定位于染色体 6p21.33，是常染色质主要的组蛋白 H3K9 甲基转移酶，催化 H3K9 的单甲基化和二甲基化[5]。G9a 表达的失调或功能紊乱与黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌等肿瘤的发生相关，抑制 G9a 的表达或甲基转移酶活性可以诱导细胞发生衰老、周期阻滞、凋亡等，显示出强大的抗肿瘤活性，提示 G9a 是肿瘤潜在的治疗靶点[5-7]。
本文以体外培养的人食管鳞癌细胞为研究对象，观察组蛋白甲基化酶 G9a 抑制剂 BIX-01294 对细胞生长、增殖的影响；分析细胞的凋亡情况，以及 G9a 催化产物 H3K9me2、DNA 双链断裂标记和细胞凋亡相关蛋白表达的变化情况；探讨 G9a 抑制剂诱导食管鳞癌细胞凋亡的作用效应和分子机制。
1 试验材料与方法
1.1 药物和细胞株
BIX-01294 购自 MedChemExpress 公司（纯度≥98%）；DMSO 配成 50mM 的母液，−80℃ 保存。食管鳞癌细胞 EC109 和 KYSE150 购自中国科学院细胞库。
1.2 试剂
胎牛血清、RPMI 1640 培养液、0.25% 胰酶-0.02% EDTA 购自 Thermo 公司；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自 BD Pharmingen 公司；兔抗人 Histone H3K9me2、Histone H3、γH2AX、H2AX、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、GAPDH 多克隆抗体和 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体均购自 Cell Signaling Technology 公司；ECL 化学发光试剂购自 Millipore 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT 实验分析 BIX-01294 的细胞毒性作用
EC109 和 KYSE150 细胞按每孔 3×103 个接种于 96 孔培养板，贴壁后弃去上清，加入 100 μL 含 1、2.5、5、7.5 和 10 μM BIX-01294 的培养液，每组设 5 个复孔，对照组加入等体积的完全培养液。药物作用 24 h，MTT 法分析 BIX-01294 对细胞生长的影响，酶标仪测定各孔 490 nm 处吸光度值（A），计算细胞存活率（%）和半数抑制浓度（IC50），实验重复 3 次。
1.3.2 集落形成实验分析细胞的增殖能力
EC109 和 KYSE150 细胞以每孔 2×103 个细胞接种于 6 孔板。细胞贴壁后，实验组加入 IC50 浓度的含药培养液，对照组加入等体积的完全培养液，继续培养 7 d；4% 多聚甲醛溶液固定 15 min，0.5% 结晶紫溶液染色 10 min，观察各组细胞集落形成的情况。
1.3.3 流式细胞术检测凋亡率
EC109 和 KYSE150 细胞以每孔 3×105 个细胞接种于 6 孔板。细胞贴壁后，实验组加入 IC50 浓度的含药培养液，空白对照组加入等体积的完全培养液；BIX-01294 作用 24 h，收集各组细胞，加入 Annexin V-FITC 标记液（5 μL）和 PI（10 μL）混匀，室温避光孵育 15 min，加入 400 μL 1×结合缓冲液，上机检测细胞凋亡率。
1.3.4 免疫印迹实验检测蛋白的表达水平
细胞培养及药物处理同 1.3.3。提取 BIX-01294 作用 24 h 的各组细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度。取各实验组 30 μg 蛋白样品行 PAGE-SDS 电泳，300 mA 恒流电转移至 PVDF 膜。3% BSA 溶液封闭 1 h，一抗抗体室温孵育 2 h，TBST 缓冲液洗膜 3 次，二抗抗体室温孵育 1 h，TBST 缓冲液洗膜 3 次。滴加 ECL 试剂于凝胶成像系统内曝光，分析目的蛋白的表达，以 GAPDH 为实验内参。
1.4 统计学分析
采用 SPSS 21.0 统计软件包分析实验数据，各组数据采用均数±标准差（±s）表示，采用 t 检验对数据进行统计学分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 BIX-01294 抑制食管鳞癌细胞的生长
不同浓度的 BIX-01294 作用 EC109 和 KYSE150 细胞 24 h，显著抑制食管鳞癌细胞的生长，呈剂量依赖关系；见图 1。BIX-01294 作用 EC109 细胞和 KYSE150 细胞 24 h 的半数抑制浓度（IC50）分别为 4.85 μM 和 5.91 μM。
图1
不同浓度 BIX-01294 对食管鳞癌细胞增殖的影响
*：
2.2 BIX-01294 抑制食管鳞癌细胞集落的形成
BIX-01294（IC50）作用 7 d，显著抑制 EC109 和 KYSE150 细胞集落的形成；见图 2。
图2
BIX-01294（IC50 浓度）对食管鳞癌细胞集落形成的影响
***：
2.3 BIX-01294 诱导食管鳞癌细胞凋亡
BIX-01294（IC50）作用 24 h，EC109 细胞凋亡率（含早期凋亡和晚期凋亡）为 42.5%±5.4%，与对照组（11.5%±2.1%）相比显著上升（P<0.05）；KYSE150 细胞凋亡率为 49.2%±5.2%，与对照组（7.5%±0.9%）相比显著上升（P<0.05）；见图 3。
图3
BIX-01294 诱导食管鳞癌细胞凋亡
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2.4 BIX-01294 抑制 G9a 催化产物的表达
免疫印迹实验发现，BIX-01294 作用 24 h，抑制 EC109 和 KYSE150 细胞表达 G9a 的催化产物 H3K9me2；见图 4。
图4
BIX-01294 抑制 G9a 催化产物的表达
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2.5 BIX-01294 促进 DNA 双链断裂标记蛋白的表达
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 细胞中 DNA 双链断裂标记蛋白 γH2AX 的表达水平显著上调；见图 5。
图5
BIX-01294 促进 DNA 双链断裂标记蛋白的表达
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2.6 BIX-01294 促进食管鳞癌细胞表达凋亡相关蛋白
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 细胞中 caspase3 和 PARP 的剪切片段 cleaved caspase3 和 cleaved PARP 的表达显著增加；见表 6。
图6
BIX-01294 促进食管鳞癌细胞表达凋亡相关蛋白
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2.7 BIX-01294 激活线粒体凋亡途径
BIX-01294 作用 24 h，EC109 和 KYSE150 细胞中 Bax 的表达显著增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达显著下降，cleaved caspase9 表达上升；见图 7。
图7
BIX-01294 激活线粒体凋亡途径
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3 讨论
研究证实，G9a 参与肿瘤细胞增殖[8]、侵袭转移[9]、干性维持[10]等生命活动的调控。我们发现，小分子化合物 BIX-01294 靶向抑制 G9a 具有诱导食管鳞癌细胞凋亡的作用。Wang 等[11]的研究结果显示，合成的 G9a 抑制剂 GA001 通过激活 p21/Bim 级联反应诱导乳腺癌细胞凋亡。BIX-01294 诱导急性 T 淋巴细胞白血病细胞[12]、肝癌细胞[13]的凋亡。86% 的胶质瘤组织中 G9a 表达阳性；BIX-01294 通过下调 Bcl-2 的表达，促进 Bax、caspase-3 和 caspase-9 的表达诱导 U251 细胞凋亡[14]。提示靶向抑制 G9a 诱导细胞凋亡是杀伤肿瘤的有效途径之一。
我们发现，DNA 双链断裂标记蛋白 γH2AX 的表达在 BIX-01294 组细胞中显著上调。磷酸化组蛋白 H2AX（phosphorylated H2AX，γH2AX）是 DNA 发生双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）时组蛋白 H2AX 的 C 末端第 139 位丝氨酸发生磷酸化的形式，γH2AX 聚集于 DSBs 位点，继而募集 DNA 损伤修复蛋白（53BP1、BRCA1 等）修复损伤维持基因组稳定性[15]。DSBs 是最致命的 DNA 损伤，不能修复的 DSBs 是诱发调亡的主要因素。在皮肤黑色素瘤组织中，γH2AX 的表达水平与 G9a 呈负相关[16]，提示 BIX-01294 诱导 DSBs 是其促进食管鳞癌细胞凋亡的机制之一。
线粒体凋亡途径的激活是启动细胞凋亡的诱因之一[17]。BIX-01294 抑制 G9a 的甲基转移酶活性可促进食管鳞癌细胞表达 Bax，并且抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达下降，cleaved caspase9 蛋白表达上升，表明线粒体凋亡途径参与 BIX-01294 诱导的食管鳞癌细胞凋亡。当 Bax 与 Bcl-2 比例上升或者 Bax 发生寡聚化将导致 Bax 在线粒体外膜上形成连通细胞质的孔道导致促凋亡内容物的外漏促进 caspase9 由酶原形式转变成活性形式，进而激活下游细胞凋亡信号通路[17]。caspase 级联反应中的效应蛋白 caspase3 在 BIX-01294 组细胞中被剪切激活；PARP 被 cleaved caspase3 水解成 89 和 24kD 的片段，失去修复 DNA 损伤的功能，受 PARP 负调控的核酸内切酶活性增高诱导细胞凋亡[18]。
本研究提示 G9a 可能是食管鳞癌潜在的治疗靶点。有研究[19]发现，抑制 G9a 的表达具有上调双特异性磷酸酶 4（DUSP4）的表达进而抑制 ERK1/2 通路诱导肿瘤细胞自噬性死亡的作用。G9a 通过抑制 CASP1 的表达抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭转移[9]。G9a 通过转录激活丝氨酸-甘氨酸生物合成通路促进肿瘤细胞的增殖[20]。BIX-01294 抑制 G9a 是否具有调控食管鳞癌细胞自噬和侵袭转移的作用及机制有待进一步的研究。
利益冲突：无。
作者贡献：吴中杰负责设计研究、初稿撰写；张雁飞、吕望、盛宏旭、朱林海负责查阅资料、数据整理和分析；胡奕负责论文审阅；胡坚指导和设计研究、负责论文审阅和修改。
