食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，全世界每年因其死亡人数高达 30 万[1]。目前，手术依然是其治疗的主要方式。对于不可切除食管癌患者治疗方法是以放疗和化疗为主的综合治疗，但总体效果不满意。其它局部治疗多采取消融技术来缓解症状，抑或减小肿瘤以达到可再次手术的目的，如射频消融、冷冻消融及微波消融[2-4]。然而，这些方法主要是以热效应发挥作用，对组织缺乏选择性。不可逆电穿孔（irreversible electroporation，IRE）技术又称纳米刀，是一种能有效消融肿瘤的新技术。IRE 主要是通过释放高压直流电，利用电极传递电脉冲，产生强力的电场，改变细胞跨膜电位，使磷脂双分子层重排，从而在细胞膜上产生永久性的纳米孔，影响细胞稳态，导致细胞凋亡[5]。与常见的消融术相比，IRE 依赖瞬间的高压电场而不是热效应来发挥作用，因此其不受大血管血流的热沉作用影响，且组织选择性较好，能保存被消融区的重要结构，如神经、大血管等[6]。IRE 在实质性肿瘤如肝癌、胰腺癌、肾肿瘤及前列腺癌等治疗应用中已经有了广泛研究[7-10]，而对食管癌这种空腔脏器方面研究较少。本研究拟应用电穿孔杯和平板电极分别对食管癌细胞、裸鼠皮下移植瘤及兔正常食管施行 IRE 处理，探索 IRE 对食管癌消融的有效性和安全性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要实验仪器和试剂
ECM830 细胞电穿孔仪、4 mm 电穿孔杯、平板电极（美国 BTX 公司），TP3090 高压电脉冲发生器（大连泰思曼科技有限公司），数字示波器（北京普源精电科技有限公司），全自动酶标仪（Cole Parmer 公司），蛋白电泳转膜仪、紫外成像分析仪（Bio-Rad 公司）；RPMI-1640 培养基、胰蛋白酶（Gibco 公司），胎牛血清（Ausbian 公司），噻唑蓝 MTT（Sigma 公司），RIPA 裂解液、BCA 试剂盒（碧云天公司），Caspase-3 抗体、Cleaved Caspase-3 抗体（Santa Cruz 公司），GAPDH 抗体（Abcam 公司），山羊抗兔二抗（Sigma 公司），ECL 显色液（美国 GE 公司），戊巴比妥钠（Sigma 公司），苏木素、伊红、中性树脂（西安晶彩生物科技有限公司）。
1.1.2 细胞培养
人食管鳞癌细胞 EC109、KYSE30 由空军军医大学唐都医院胸外科实验室提供，用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基进行培养，静置于 37 ℃，5% CO2 培养箱中。取对数生长期的细胞进行后续实验。
1.1.3 实验动物
所需实验动物由空军军医大学实验动物中心提供。5 周龄健康雌性 BALB/c 裸鼠 8 只，均在 SPF 级环境下饲养；雌性新西兰大白兔 10 只，体重 2.5 ～ 3.5 kg，在清洁实验条件下饲养。实验前饲养一周以熟悉环境。
1.2 实验方法
1.2.1 MTT 细胞存活率检测
EC109、KYSE30 细胞生长到对数期时，用胰蛋白酶消化，800 g 离心 5 min，用 PBS 重悬，将细胞浓度调整为 1×106个/mL。然后将 600 μL 细胞重悬液加到 4 mm 电穿孔杯中，用 ECM830 电穿孔仪进行 IRE 处理，施加直流方波脉冲 50 个，脉冲长度 100 μs，脉冲间隔 1 s，按电压不同，分为 Control、500 V/cm、1000 V/cm、1500 V/cm、2000 V/cm 五组。IRE 处理后细胞分别接种到 96 孔板中，24 h 后每孔中加入 20 μL MTT 溶液，孵育 4 h，吸弃上清液，每孔再加入 150 μL DMSO，振荡 10 min 后在全自动酶标仪上检测各孔的吸光度值。
1.2.2 Western blotting 检测
分别收集正常及 IRE 处理的 EC109、KYSE30 细胞，提取蛋白并用 BCA 法测定各样品的蛋白浓度，按 1:4 加入蛋白上样缓冲液，煮沸、离心。进行 SDS-PAGE 电泳，每孔上样量 20 μg，再转移至硝酸纤维素（PVDF）膜上，BSA 室温封闭 1.5 ～ 2 h，TBST 洗膜后加入稀释好的 Caspase-3（1∶1000）、Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗体，4 ℃ 过夜；次日用 TBST 洗膜，再加入稀释好的山羊抗兔二抗，室温 1 ～ 1.5 h，TBST 洗膜后加入 ECL 显色液，显影照相。
1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的建立
用胰蛋白酶消化处于对数生长期的 EC109 细胞，PBS 清洗两次，PBS 重悬细胞并调整浓度为 2.5×107个/mL。8 只 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠平均分为两组（Control 组、IRE 组），取 200 μL EC109 细胞悬液注入裸鼠右侧背部皮下，每隔一天检测肿瘤生长情况。
1.2.4 IRE 处理裸鼠肿瘤
当裸鼠肿瘤生长至 6 ～ 8 mm 时，腹腔注射 1% 戊巴比妥钠进行麻醉，固定于操作台上，调整平板电极间距并加持肿瘤，行 IRE 处理，设备输出参数：50 个脉冲，场强 2 000 V/cm(电压/电极间距)，波长 100 μs，间隔 1 s，频率为 1 Hz。IRE 处理 14 d 后，处死裸鼠，剥离取出瘤体，称量瘤体重量，并用游标卡尺测量瘤体的大小，根据公式（体积=长径×短径2×0.5）计算瘤体体积。
1.2.5 IRE 处理兔食管
将 10 只新西兰大白兔平均分成两组（Control 组、IRE 组），禁食水 24 h 后，按 30 mg/kg 经耳缘静脉注入 3% 戊巴比妥钠麻醉，然后仰卧位固定于操作台上，沿腹正中切口暴露腹腔，找到腹段食管。IRE 组将平板电极间距加持食管，并输出脉冲：50 个脉冲，场强 2 000 V/cm，波长 100 μs，间隔 1 s；Control 组操作同 IRE 组，但不输出脉冲。术后缝合切口，并连续 3 d 给予肌肉注射 40 万单位青霉素抗感染治疗。7 d 后，将实验兔安乐死，取腹段食管组织，进行组织病理检测。
1.2.6 HE 染色
将获得的食管组织置于多聚甲醛中，脱水后进行石蜡包埋，将切片机调成 5 μm 厚度进行切片，经二甲苯、梯度酒精脱蜡，苏木精溶液浸泡 2 min 染色，弱碱液中反蓝，再用自来水冲洗干净，脱水，中性树脂封片，显微镜观察。
1.2.7 Masson 染色
将食管组织石蜡切片进行脱蜡，苏木精溶液浸泡 10 min 染色，水洗后用 1% 的盐酸-乙醇分化 1 ～ 3 s，水洗后放入促蓝液中，再水洗后用立春红酸性复红液浸泡 10 min 染色，2% 冰醋酸溶液水洗后用 1% 磷钼酸溶液分化 3 ～ 5 min，再用苯胺蓝染色 5 min，0.2% 冰醋酸溶液水洗，脱水，中性树脂封片，显微镜观察。
1.3 统计学分析
采用 SPSS19.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 时表示差异有统计学意义。
1.4 伦理审查
本研究已通过空军军医大学实验动物伦理委员会审批，批准号：20191106。
2 结果
2.1 IRE 促进食管癌细胞的凋亡
为了检测不同电场强度对食管癌细胞的灭活作用，用 MTT 法检测 IRE 处理后食管癌细胞 EC109、KYSE30 的增殖情况，结果显示当电场强度较小时（500 V/cm），IRE 处理后食管癌细胞的增殖与对照组无差异，而随着电场强度的增加，IRE 对食管癌细胞增殖的影响逐渐加重，当达到 2 000 V/cm 时，IRE 处理后基本上无增殖（P<0.001）；见图 1。用 Western blotting 方法检测 IRE 处理后，食管癌细胞 EC109、KYSE30 凋亡相关蛋白 Caspase-3、Cleaved Caspase-3 的表达，以 Caspase-3/GAPDH 及 Cleaved Caspase-3/GAPDH 相对灰度度值为结果计算相对表达量，结果显示 IRE 处理能够增加 EC109、KYSE30 凋亡相关蛋白 Cleaved Caspase-3 的表达，提示 IRE 可以促进食管癌细胞的凋亡；见图 2。
图1
不同电场强度 IRE 对食管癌细胞 EC109（a）、KYSE30（b）的作用
NS：与对照组比较，差异无统计学意义；**：与对照组比较，
图2
Western blotting 检测凋亡蛋白的表达
a：Western blotting 检测 IRE 处理后食管癌细胞 Caspase-3、Cleaved Caspase-3 表达情况的代表性图像；b：Caspase-3 表达的半定量分析；c：Cleaved Caspase-3 表达的半定量分析；NS：与对照组比较，差异无统计学意义；**：与对照组比较，
2.2 IRE 能够抑制食管肿瘤的生长
采用 TP3090 高压脉冲发生器（图 3a）产生稳定的电脉冲，用示波器（图 3b）显示脉冲的波形以保证各项参数的准确性，用平板电极（图 3c）输出电脉冲以发挥作用；建立裸鼠皮下 EC109 食管癌移植瘤，用平板电极行 IRE 处理（图 4a），到达时间节点后处死裸鼠，剥离瘤体（图 4b），测量其体积及重量，结果显示，IRE 处理后裸鼠移植瘤体积减小、重量减轻（P<0.05）（图 4cd），表明 IRE 能够抑制食管肿瘤的生长。
图3
进行动物 IRE 实验相关仪器
a：TP3090 高压脉冲发生器；b：示波器；c：平板电极
图4
IRE 对裸鼠皮下移植瘤的作用
a：用平板电极对裸鼠进行 IRE 处理；b：裸鼠皮下移植瘤剥离后大体观；c：瘤体体积统计图；d：瘤体重量统计图；*：
2.3 IRE 处理对实验兔食管是安全的
用平板电极对实验兔食管行 IRE 处理（图 5a），与对照组相比，IRE 组实验兔一天后开始进食进水，观察 1 周，实验兔体重未发生明显变化，没有发生食管瘘的情况；病理学检测可见，食管组织中，食管内膜细胞及肌细胞等发生凋亡，而间质组织受到破坏较小，对后期食管组织的恢复有着重大作用（图 5b、c、d、e）；而 Masson 染色显示，正常食管组织与 IRE 治疗后的食管组织在纤维分布较一致，IRE 对纤维组织没有影响，保持了组织的框架结构，有利于 IRE 治疗后正常组织的恢复（图 6）；表明 IRE 处理应用到食管组织也是安全有效的。
图5
实验兔食管组织 HE 染色
a：用平板电极对兔食管进行 IRE 处理；Control 组 HE 染色 b（100×）、c（200×）；IRE 处理后 HE 染色 d（100×）、e（200×）
图6
实验兔食管组织 Masson 染色
用平板电极对兔食管进行 IRE 处理；Control 组 Masson 染色 a（100×）、b（200×）；IRE 处理后 Masson 染色 c（100×）、d（200×）
3 讨论
食管癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率均居恶性肿瘤前列。在我国，食管癌在男性新发恶性肿瘤中排第三位，在女性新发恶性肿瘤中排第五位[1,11]。手术是食管癌治疗的主要方式，但由于早期诊断困难，多数患者就诊时已属中晚期，失去手术切除机会。对无法手术的患者，临床大多采用姑息性放疗、化疗等综合治疗，总体效果不满意[12]。除此之外，局部微创消融治疗也可减轻肿瘤负荷，缓解症状，甚至通过减小肿瘤以达到再次手术目的。然而，像射频、冷冻和微波消融等局部消融方法，发挥作用的机理都是通过热效应来实现，对组织选择性差，在杀死肿瘤细胞的同时，对间质组织也会产生巨大的破坏，不利于治疗后组织的恢复[13]。另外能量多少不易控制，在消融区易发生粘连甚至食管瘘[14]。
IRE 作为一种新的软组织消融技术，其主要是通过高压直流电在消融区内的细胞膜上不可逆地产生多个纳米级小孔，从而导致细胞死亡。由于其发挥作用依赖的是微秒级的超短电脉冲，因此在消融过程中几乎不产热[15-16]。与传统的局部消融手段相比，其主要有以下特点：因不依赖于热效应，所以不受大血管的冷热消除效应的影响；消融过程中对胶原等纤维结缔组织无影响，不易损伤大血管、神经等重要组织结构；消融边界清晰，易于对消融效果做出准确判断；消融区炎症反应轻微；治疗时间短，可多次消融[17-19]。目前，IRE 已被用于多种实质性肿瘤的研究应用当中，如胰腺癌、肝癌、前列腺癌等[7-10]，甚至因毗邻重要结构无法用传统消融方法治疗的肿瘤类型，如肝门肿瘤，且显示出良好的作用[20]。然而 IRE 在食管癌方面的研究较少。
本研究旨在探讨 IRE 在食管癌方面的治疗效果及安全性。首先，利用相关细胞实验，检测 IRE 的作用并筛选出合适的参数。IRE 大多采用脉宽为 100 μs 的电脉冲，其发挥作用主要受电脉冲的个数及电场强度的影响[21]，我们参考其他研究将电脉冲个数固定为 50 个，通过改变电场强度观察其效果。结果显示当电场强度为 500 V/cm 时，单纯的 IRE 并无明显的杀伤作用，因为当电场强度较小时，虽然也能在细胞膜上产生小孔，但这个过程是可逆的，当去除电场作用后，这些小孔就会慢慢闭合，对细胞影响较小[22]。而随着电场强度的不断加大，细胞膜上的小孔变为不可逆的，IRE 对食管癌细胞的杀伤作用也越来越强，当达到 2 000 V/cm 时，其作用基本最大化，也以此作为后续研究的参数。我们检测了凋亡相关蛋白如 Cleaved Caspase-3 的表达，也显示 IRE 处理后是增加的，表明 IRE 能够促进食管癌细胞的凋亡。接着我们检测 IRE 对在体食管肿瘤的作用，应用食管癌细胞 EC109 建立裸鼠皮下移植瘤模型，利用平板电极行 IRE 处理，观察其对肿瘤生长的作用。与体外实验相一致，IRE 能够减小瘤体体积，减轻瘤体重量，抑制肿瘤的生长。食管是一种空腔脏器，治疗处理不当容易引起食管瘘等并发症，因此我们应用平板电极对正常新西兰大白兔食管进行 IRE 处理，观察其效果。结果显示 IRE 处理后并无食管瘘等不良反应的发生，且能够对食管组织的实质细胞产生杀伤作用，而对纤维等结缔组织的影响较小，这也有利于治疗后消融区组织的修复。Neven K 等[23]研究也显示对正常猪食管进行 IRE 处理后，无不良反应发生，且间质组织不受损害。
综上，IRE 消融对食管癌细胞具有杀伤作用，能够减缓食管肿瘤的生长，且在食管组织中应用是安全的，为进一步的临床应用奠定理论及实验基础。
利益冲突：无。
作者贡献：夏彦民负责实验设计及完成，论文撰写；朱建飞负责部分裸鼠实验；王文辰负责细胞及分子生物学检测；姜涛负责实验设计和论文审校。
食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，全世界每年因其死亡人数高达 30 万[1]。目前，手术依然是其治疗的主要方式。对于不可切除食管癌患者治疗方法是以放疗和化疗为主的综合治疗，但总体效果不满意。其它局部治疗多采取消融技术来缓解症状，抑或减小肿瘤以达到可再次手术的目的，如射频消融、冷冻消融及微波消融[2-4]。然而，这些方法主要是以热效应发挥作用，对组织缺乏选择性。不可逆电穿孔（irreversible electroporation，IRE）技术又称纳米刀，是一种能有效消融肿瘤的新技术。IRE 主要是通过释放高压直流电，利用电极传递电脉冲，产生强力的电场，改变细胞跨膜电位，使磷脂双分子层重排，从而在细胞膜上产生永久性的纳米孔，影响细胞稳态，导致细胞凋亡[5]。与常见的消融术相比，IRE 依赖瞬间的高压电场而不是热效应来发挥作用，因此其不受大血管血流的热沉作用影响，且组织选择性较好，能保存被消融区的重要结构，如神经、大血管等[6]。IRE 在实质性肿瘤如肝癌、胰腺癌、肾肿瘤及前列腺癌等治疗应用中已经有了广泛研究[7-10]，而对食管癌这种空腔脏器方面研究较少。本研究拟应用电穿孔杯和平板电极分别对食管癌细胞、裸鼠皮下移植瘤及兔正常食管施行 IRE 处理，探索 IRE 对食管癌消融的有效性和安全性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要实验仪器和试剂
ECM830 细胞电穿孔仪、4 mm 电穿孔杯、平板电极（美国 BTX 公司），TP3090 高压电脉冲发生器（大连泰思曼科技有限公司），数字示波器（北京普源精电科技有限公司），全自动酶标仪（Cole Parmer 公司），蛋白电泳转膜仪、紫外成像分析仪（Bio-Rad 公司）；RPMI-1640 培养基、胰蛋白酶（Gibco 公司），胎牛血清（Ausbian 公司），噻唑蓝 MTT（Sigma 公司），RIPA 裂解液、BCA 试剂盒（碧云天公司），Caspase-3 抗体、Cleaved Caspase-3 抗体（Santa Cruz 公司），GAPDH 抗体（Abcam 公司），山羊抗兔二抗（Sigma 公司），ECL 显色液（美国 GE 公司），戊巴比妥钠（Sigma 公司），苏木素、伊红、中性树脂（西安晶彩生物科技有限公司）。
1.1.2 细胞培养
人食管鳞癌细胞 EC109、KYSE30 由空军军医大学唐都医院胸外科实验室提供，用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基进行培养，静置于 37 ℃，5% CO2 培养箱中。取对数生长期的细胞进行后续实验。
1.1.3 实验动物
所需实验动物由空军军医大学实验动物中心提供。5 周龄健康雌性 BALB/c 裸鼠 8 只，均在 SPF 级环境下饲养；雌性新西兰大白兔 10 只，体重 2.5 ～ 3.5 kg，在清洁实验条件下饲养。实验前饲养一周以熟悉环境。
1.2 实验方法
1.2.1 MTT 细胞存活率检测
EC109、KYSE30 细胞生长到对数期时，用胰蛋白酶消化，800 g 离心 5 min，用 PBS 重悬，将细胞浓度调整为 1×106个/mL。然后将 600 μL 细胞重悬液加到 4 mm 电穿孔杯中，用 ECM830 电穿孔仪进行 IRE 处理，施加直流方波脉冲 50 个，脉冲长度 100 μs，脉冲间隔 1 s，按电压不同，分为 Control、500 V/cm、1000 V/cm、1500 V/cm、2000 V/cm 五组。IRE 处理后细胞分别接种到 96 孔板中，24 h 后每孔中加入 20 μL MTT 溶液，孵育 4 h，吸弃上清液，每孔再加入 150 μL DMSO，振荡 10 min 后在全自动酶标仪上检测各孔的吸光度值。
1.2.2 Western blotting 检测
分别收集正常及 IRE 处理的 EC109、KYSE30 细胞，提取蛋白并用 BCA 法测定各样品的蛋白浓度，按 1:4 加入蛋白上样缓冲液，煮沸、离心。进行 SDS-PAGE 电泳，每孔上样量 20 μg，再转移至硝酸纤维素（PVDF）膜上，BSA 室温封闭 1.5 ～ 2 h，TBST 洗膜后加入稀释好的 Caspase-3（1∶1000）、Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗体，4 ℃ 过夜；次日用 TBST 洗膜，再加入稀释好的山羊抗兔二抗，室温 1 ～ 1.5 h，TBST 洗膜后加入 ECL 显色液，显影照相。
1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的建立
用胰蛋白酶消化处于对数生长期的 EC109 细胞，PBS 清洗两次，PBS 重悬细胞并调整浓度为 2.5×107个/mL。8 只 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠平均分为两组（Control 组、IRE 组），取 200 μL EC109 细胞悬液注入裸鼠右侧背部皮下，每隔一天检测肿瘤生长情况。
1.2.4 IRE 处理裸鼠肿瘤
当裸鼠肿瘤生长至 6 ～ 8 mm 时，腹腔注射 1% 戊巴比妥钠进行麻醉，固定于操作台上，调整平板电极间距并加持肿瘤，行 IRE 处理，设备输出参数：50 个脉冲，场强 2 000 V/cm(电压/电极间距)，波长 100 μs，间隔 1 s，频率为 1 Hz。IRE 处理 14 d 后，处死裸鼠，剥离取出瘤体，称量瘤体重量，并用游标卡尺测量瘤体的大小，根据公式（体积=长径×短径2×0.5）计算瘤体体积。
1.2.5 IRE 处理兔食管
将 10 只新西兰大白兔平均分成两组（Control 组、IRE 组），禁食水 24 h 后，按 30 mg/kg 经耳缘静脉注入 3% 戊巴比妥钠麻醉，然后仰卧位固定于操作台上，沿腹正中切口暴露腹腔，找到腹段食管。IRE 组将平板电极间距加持食管，并输出脉冲：50 个脉冲，场强 2 000 V/cm，波长 100 μs，间隔 1 s；Control 组操作同 IRE 组，但不输出脉冲。术后缝合切口，并连续 3 d 给予肌肉注射 40 万单位青霉素抗感染治疗。7 d 后，将实验兔安乐死，取腹段食管组织，进行组织病理检测。
1.2.6 HE 染色
将获得的食管组织置于多聚甲醛中，脱水后进行石蜡包埋，将切片机调成 5 μm 厚度进行切片，经二甲苯、梯度酒精脱蜡，苏木精溶液浸泡 2 min 染色，弱碱液中反蓝，再用自来水冲洗干净，脱水，中性树脂封片，显微镜观察。
1.2.7 Masson 染色
将食管组织石蜡切片进行脱蜡，苏木精溶液浸泡 10 min 染色，水洗后用 1% 的盐酸-乙醇分化 1 ～ 3 s，水洗后放入促蓝液中，再水洗后用立春红酸性复红液浸泡 10 min 染色，2% 冰醋酸溶液水洗后用 1% 磷钼酸溶液分化 3 ～ 5 min，再用苯胺蓝染色 5 min，0.2% 冰醋酸溶液水洗，脱水，中性树脂封片，显微镜观察。
1.3 统计学分析
采用 SPSS19.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 时表示差异有统计学意义。
1.4 伦理审查
本研究已通过空军军医大学实验动物伦理委员会审批，批准号：20191106。
2 结果
2.1 IRE 促进食管癌细胞的凋亡
为了检测不同电场强度对食管癌细胞的灭活作用，用 MTT 法检测 IRE 处理后食管癌细胞 EC109、KYSE30 的增殖情况，结果显示当电场强度较小时（500 V/cm），IRE 处理后食管癌细胞的增殖与对照组无差异，而随着电场强度的增加，IRE 对食管癌细胞增殖的影响逐渐加重，当达到 2 000 V/cm 时，IRE 处理后基本上无增殖（P<0.001）；见图 1。用 Western blotting 方法检测 IRE 处理后，食管癌细胞 EC109、KYSE30 凋亡相关蛋白 Caspase-3、Cleaved Caspase-3 的表达，以 Caspase-3/GAPDH 及 Cleaved Caspase-3/GAPDH 相对灰度度值为结果计算相对表达量，结果显示 IRE 处理能够增加 EC109、KYSE30 凋亡相关蛋白 Cleaved Caspase-3 的表达，提示 IRE 可以促进食管癌细胞的凋亡；见图 2。
图1
不同电场强度 IRE 对食管癌细胞 EC109（a）、KYSE30（b）的作用
NS：与对照组比较，差异无统计学意义；**：与对照组比较，
图2
Western blotting 检测凋亡蛋白的表达
a：Western blotting 检测 IRE 处理后食管癌细胞 Caspase-3、Cleaved Caspase-3 表达情况的代表性图像；b：Caspase-3 表达的半定量分析；c：Cleaved Caspase-3 表达的半定量分析；NS：与对照组比较，差异无统计学意义；**：与对照组比较，
2.2 IRE 能够抑制食管肿瘤的生长
采用 TP3090 高压脉冲发生器（图 3a）产生稳定的电脉冲，用示波器（图 3b）显示脉冲的波形以保证各项参数的准确性，用平板电极（图 3c）输出电脉冲以发挥作用；建立裸鼠皮下 EC109 食管癌移植瘤，用平板电极行 IRE 处理（图 4a），到达时间节点后处死裸鼠，剥离瘤体（图 4b），测量其体积及重量，结果显示，IRE 处理后裸鼠移植瘤体积减小、重量减轻（P<0.05）（图 4cd），表明 IRE 能够抑制食管肿瘤的生长。
图3
进行动物 IRE 实验相关仪器
a：TP3090 高压脉冲发生器；b：示波器；c：平板电极
图4
IRE 对裸鼠皮下移植瘤的作用
a：用平板电极对裸鼠进行 IRE 处理；b：裸鼠皮下移植瘤剥离后大体观；c：瘤体体积统计图；d：瘤体重量统计图；*：
2.3 IRE 处理对实验兔食管是安全的
用平板电极对实验兔食管行 IRE 处理（图 5a），与对照组相比，IRE 组实验兔一天后开始进食进水，观察 1 周，实验兔体重未发生明显变化，没有发生食管瘘的情况；病理学检测可见，食管组织中，食管内膜细胞及肌细胞等发生凋亡，而间质组织受到破坏较小，对后期食管组织的恢复有着重大作用（图 5b、c、d、e）；而 Masson 染色显示，正常食管组织与 IRE 治疗后的食管组织在纤维分布较一致，IRE 对纤维组织没有影响，保持了组织的框架结构，有利于 IRE 治疗后正常组织的恢复（图 6）；表明 IRE 处理应用到食管组织也是安全有效的。
图5
实验兔食管组织 HE 染色
a：用平板电极对兔食管进行 IRE 处理；Control 组 HE 染色 b（100×）、c（200×）；IRE 处理后 HE 染色 d（100×）、e（200×）
图6
实验兔食管组织 Masson 染色
用平板电极对兔食管进行 IRE 处理；Control 组 Masson 染色 a（100×）、b（200×）；IRE 处理后 Masson 染色 c（100×）、d（200×）
3 讨论
食管癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率均居恶性肿瘤前列。在我国，食管癌在男性新发恶性肿瘤中排第三位，在女性新发恶性肿瘤中排第五位[1,11]。手术是食管癌治疗的主要方式，但由于早期诊断困难，多数患者就诊时已属中晚期，失去手术切除机会。对无法手术的患者，临床大多采用姑息性放疗、化疗等综合治疗，总体效果不满意[12]。除此之外，局部微创消融治疗也可减轻肿瘤负荷，缓解症状，甚至通过减小肿瘤以达到再次手术目的。然而，像射频、冷冻和微波消融等局部消融方法，发挥作用的机理都是通过热效应来实现，对组织选择性差，在杀死肿瘤细胞的同时，对间质组织也会产生巨大的破坏，不利于治疗后组织的恢复[13]。另外能量多少不易控制，在消融区易发生粘连甚至食管瘘[14]。
IRE 作为一种新的软组织消融技术，其主要是通过高压直流电在消融区内的细胞膜上不可逆地产生多个纳米级小孔，从而导致细胞死亡。由于其发挥作用依赖的是微秒级的超短电脉冲，因此在消融过程中几乎不产热[15-16]。与传统的局部消融手段相比，其主要有以下特点：因不依赖于热效应，所以不受大血管的冷热消除效应的影响；消融过程中对胶原等纤维结缔组织无影响，不易损伤大血管、神经等重要组织结构；消融边界清晰，易于对消融效果做出准确判断；消融区炎症反应轻微；治疗时间短，可多次消融[17-19]。目前，IRE 已被用于多种实质性肿瘤的研究应用当中，如胰腺癌、肝癌、前列腺癌等[7-10]，甚至因毗邻重要结构无法用传统消融方法治疗的肿瘤类型，如肝门肿瘤，且显示出良好的作用[20]。然而 IRE 在食管癌方面的研究较少。
本研究旨在探讨 IRE 在食管癌方面的治疗效果及安全性。首先，利用相关细胞实验，检测 IRE 的作用并筛选出合适的参数。IRE 大多采用脉宽为 100 μs 的电脉冲，其发挥作用主要受电脉冲的个数及电场强度的影响[21]，我们参考其他研究将电脉冲个数固定为 50 个，通过改变电场强度观察其效果。结果显示当电场强度为 500 V/cm 时，单纯的 IRE 并无明显的杀伤作用，因为当电场强度较小时，虽然也能在细胞膜上产生小孔，但这个过程是可逆的，当去除电场作用后，这些小孔就会慢慢闭合，对细胞影响较小[22]。而随着电场强度的不断加大，细胞膜上的小孔变为不可逆的，IRE 对食管癌细胞的杀伤作用也越来越强，当达到 2 000 V/cm 时，其作用基本最大化，也以此作为后续研究的参数。我们检测了凋亡相关蛋白如 Cleaved Caspase-3 的表达，也显示 IRE 处理后是增加的，表明 IRE 能够促进食管癌细胞的凋亡。接着我们检测 IRE 对在体食管肿瘤的作用，应用食管癌细胞 EC109 建立裸鼠皮下移植瘤模型，利用平板电极行 IRE 处理，观察其对肿瘤生长的作用。与体外实验相一致，IRE 能够减小瘤体体积，减轻瘤体重量，抑制肿瘤的生长。食管是一种空腔脏器，治疗处理不当容易引起食管瘘等并发症，因此我们应用平板电极对正常新西兰大白兔食管进行 IRE 处理，观察其效果。结果显示 IRE 处理后并无食管瘘等不良反应的发生，且能够对食管组织的实质细胞产生杀伤作用，而对纤维等结缔组织的影响较小，这也有利于治疗后消融区组织的修复。Neven K 等[23]研究也显示对正常猪食管进行 IRE 处理后，无不良反应发生，且间质组织不受损害。
综上，IRE 消融对食管癌细胞具有杀伤作用，能够减缓食管肿瘤的生长，且在食管组织中应用是安全的，为进一步的临床应用奠定理论及实验基础。
利益冲突：无。
作者贡献：夏彦民负责实验设计及完成，论文撰写；朱建飞负责部分裸鼠实验；王文辰负责细胞及分子生物学检测；姜涛负责实验设计和论文审校。
